使用簡(jian)化(hua)的Coral Cryo電(dian)子斷層掃描工作流(liu)程確保(bao)成功(gong)

低(di)(di)溫電子(zi)斷層掃描(miao)（CryoET）是一種成(cheng)像技術，可以(yi)讓研(yan)究人(ren)員(yuan)(yuan)以(yi)亞納米分(fen)辨率觀察(cha)蛋白質和(he)其(qi)他大生物(wu)分(fen)子(zi)。了(le)解(jie)分(fen)子(zi)的(de)形狀和(he)結構(gou)，包(bao)括口(kou)袋和(he)裂隙，可以(yi)幫助研(yan)究人(ren)員(yuan)(yuan)設計能夠像拼圖(tu)一樣附著于分(fen)子(zi)的(de)藥物(wu)。低(di)(di)溫ET成(cheng)像也因(yin)此(ci)成(cheng)為了(le)解(jie)和(he)治(zhi)療疾病和(he)失調(diao)的(de)重要基礎(chu)。

了解徠卡顯微系(xi)統的(de)無縫冷凍電子斷層掃描流程(cheng)Coral Cryo如何使用(yong)共聚焦超分(fen)辨率更精(jing)確地定位您的(de)意向結(jie)構。利用(yong)該工作流程(cheng)，您可以可靠地快速部署實驗，實現更好的(de)可重復性(xing)(xing)、靈活性(xing)(xing)，并(bing)提高最(zui)終結(jie)果的(de)準(zhun)確性(xing)(xing)。

冷凍電子斷層掃描(CryoET)

使用(yong)了(le)冷凍電子斷(duan)層掃(sao)描（Cryo TEM），將(jiang)在細胞(bao)環(huan)境(jing)內觀察生物分(fen)子的分(fen)辨率提升到(dao)了(le)1nm，達到(dao)了(le)qian suo wei you的精度。通(tong)過這種方式，可以僅通(tong)過其形狀來識別單個蛋白質，而(er)且無需任何標記，甚至(zhi)可以區(qu)分(fen)不同的構象(xiang)，幫(bang)助深入(ru)理(li)解分(fen)子社會學。

CryoET成像為理解空間蛋白質結構(gou)和相互作用提供了一種(zhong)全新的(de)方(fang)法，有(you)助于解讀(du)細胞(bao)機制并應用這些見(jian)解。例如，它們可能有(you)助于開發多種(zhong)疾病的(de)治(zhi)療方(fang)法。

但是，亞納米分辨率的(de)(de)成(cheng)(cheng)像(xiang)(xiang)存在多(duo)(duo)種(zhong)挑戰(zhan)：它的(de)(de)成(cheng)(cheng)本高昂，需(xu)要大量的(de)(de)培(pei)訓，涉及許多(duo)(duo)儀器操作(zuo)，而且大多(duo)(duo)數(shu)情(qing)況下，電子顯微鏡(jing)（EM）無法選擇性地顯示目(mu)標(biao)結(jie)構。為確保(bao)高成(cheng)(cheng)功率，在工作(zuo)流(liu)程的(de)(de)光鏡(jing)（LM）階(jie)段，需(xu)要以盡可能高的(de)(de)分辨率識別和定(ding)位EM成(cheng)(cheng)像(xiang)(xiang)的(de)(de)目(mu)標(biao)體積(ji)。

徠卡顯微系統的無(wu)縫(feng)低溫電子斷(duan)層(ceng)掃描工作流(liu)程(cheng)Coral使用共焦(jiao)超(chao)分辨率(lv)進行精確(que)定位。該工作流(liu)程(cheng)不僅減少了(le)樣本(ben)制備的步(bu)驟，還提高了(le)樣本(ben)裝載(zai)和轉(zhuan)移的成(cheng)功(gong)率(lv)，從而提高了(le)On-Grid Lamella/CryoET工作流(liu)程(cheng)的效率(lv)。

目標坐標以開放格式提供給后續的FIB研磨和LM-EM關聯。因此，您可以實現更高的工作效率和更好的實驗可再現性。這可以幫助您加速設施中的方案部署，并提高最終結果的準確性。

精確的三維體積定位

STELLARIS 5低溫共聚焦(jiao)顯(xian)微鏡，包(bao)括低溫平臺和轉移梭，是Coral Cryo工(gong)作流程中精確定(ding)位(wei)的核心部分。與寬視場(chang)儀器相比，共焦(jiao)顯(xian)微鏡的Z分辨率更高(gao)，在(zai)設計上(shang)更適合三維(wei)定(ding)位(wei)。

通(tong)過在后續的高精(jing)度關聯中(zhong)應用超分(fen)辨率的數(shu)據，STELLARIS 5 Cryo作為一個獨立(li)的組件，性能(neng)優于使用集(ji)成(cheng)光(guang)鏡進行定位的EM解決方案，同時也釋(shi)放了(le)寶貴(gui)的EM儀器時間。

使用熒光珠在樣本(ben)上施加一個基準標記。通(tong)過確定它們在三維圖像數據(ju)中(zhong)的(de)位置，可以(yi)顯著(zhu)提(ti)高Z軸(zhou)上的(de)定位精度(du)。此外，徠卡還開(kai)發了一種基于插值的(de)方法，能夠以(yi)比系統(tong)的(de)實(shi)際光學分(fen)辨率(lv)更高的(de)精度(du)找到(dao)熒光珠中(zhong)心（正在申請zhuan li）。

LAS X Coral Cryo：基(ji)于插(cha)值的三(san)維定(ding)位，使用X和Y方(fang)向的Z-堆棧的截面。標記可在所(suo)有(you)相關窗(chuang)口中交(jiao)互(hu)移動。

安全完成工作流程的各個階段

STELLARIS 5 Cryo可結合(he)先進的(de)(de)CryoET定位軟件(jian)（LAS X Coral Cryo），還可以無(wu)縫集成和轉移(yi)到低(di)溫FIB或VCT平(ping)臺。傳統的(de)(de)低(di)溫電子斷層掃描的(de)(de)工作流程包含多個復雜的(de)(de)步(bu)驟(zou)，特別容易出錯(cuo)，并經常破(po)壞(huai)后續重要的(de)(de)成像步(bu)驟(zou)。人工準備、處理和轉移(yi)樣(yang)(yang)本的(de)(de)步(bu)驟(zou)不僅麻煩、繁瑣，還可能(neng)導致樣(yang)(yang)本污染或反玻璃(li)化。

Coral Cryo的(de)(de)工作流(liu)程改變了這(zhe)一(yi)點。通過簡化工作流(liu)程，可(ke)以實現更廣泛的(de)(de)CryoET應(ying)用。精簡的(de)(de)步驟、高(gao)靈活性(xing)和安全(quan)性(xing)，可(ke)確保樣本的(de)(de)活力、質量檢查(cha)，實現精確和可(ke)靠的(de)(de)三維定位機制。

低溫平(ping)(ping)臺(tai)是一(yi)個更穩定的封(feng)閉系統，更容易(yi)操作，且無需從平(ping)(ping)臺(tai)上取(qu)下冷卻插(cha)件。樣(yang)本(ben)轉移梭的裝載過程簡單(dan)，可(ke)將樣(yang)本(ben)損失(shi)的風(feng)險降(jiang)至(zhi)zui di，并促(cu)進沿儀(yi)器平臺(tai)的轉移。

STELLARIS 5 Cryo可結(jie)合先進的冷(leng)凍電(dian)子(zi)斷層掃描定位(wei)軟件 (LAS X Coral Cryo)，并與冷(leng)凍FIB或VCT階段的各種無縫集成和傳輸選件結(jie)合使(shi)用。

 Clamydomonas TauSense比例(li)尺10µm

Coral Cryo - 工作原(yuan)理

集成解決方案的優勢

如果沒有準(zhun)確(que)的(de)(de)目(mu)(mu)標(biao)位置，片狀目(mu)(mu)標(biao)區(qu)域的(de)(de)方(fang)法通常(chang)是一種耗時的(de)(de)迭代方(fang)法。與集成 LM-EM版本相比，使用Coral Cryo工作流(liu)程和(he)STELLARIS 5 Cryo共(gong)聚(ju)焦顯微鏡可(ke)以通過(guo)共(gong)聚(ju)焦技術(shu)提供(gong)更高(gao)的(de)(de)分辨(bian)率，更好的(de)(de)圖像質量和(he)更高(gao)的(de)(de)Z分辨(bian)率。Coral Cryo為精確(que)檢測目(mu)(mu)標(biao)熒光提供(gong)了光譜(pu)靈活性，我們du te的(de)(de)TauSense技術(shu)

以消(xiao)除不需要的自發熒(ying)光，并對目(mu)標識(shi)別進行微調(diao)，在進入EM階段之前可以預先檢查。

用TauSense成(cheng)(cheng)像(xiang)工(gong)具檢(jian)查硅(gui)藻。光(guang)(guang)譜-500-640 nm光(guang)(guang)譜帶的(de)(de)強度(du)圖像(xiang)。TauContrast-Look-up-table表示(shi)光(guang)(guang)子的(de)(de)平均(jun)(jun)到達(da)時(shi)間；短(duan)的(de)(de)到達(da)時(shi)間為藍色，長的(de)(de)到達(da)時(shi)間由(you)黃色過渡(du)到紅(hong)色。顯示(shi)了不同的(de)(de)結(jie)構。TauSeparation-T光(guang)(guang)譜成(cheng)(cheng)分(fen)被分(fen)離(li)，成(cheng)(cheng)分(fen)1顯示(shi)葉(xie)綠(lv)體的(de)(de)自發熒光(guang)(guang)，0.1 ns；成(cheng)(cheng)分(fen)2顯示(shi)純凈的(de)(de)LifeAct-GFP信號，平均(jun)(jun)到達(da)時(shi)間2.7 ns。樣(yang)本(ben)由(you)德國TU Dresden，B CUBE的(de)(de)Nicole Poulsen提供。

靈活性

Coral Cryo提(ti)供兩(liang)種不同的(de)(de)(de)工作(zuo)(zuo)流(liu)(liu)程解決(jue)方案，為低溫FIB顯微鏡提(ti)供高靈活性。通(tong)(tong)過(guo)我(wo)(wo)們(men)靈活的(de)(de)(de)工作(zuo)(zuo)流(liu)(liu)程，我(wo)(wo)們(men)的(de)(de)(de)低溫傳輸系統EMVCT可以連接市場(chang)上所有的(de)(de)(de)低溫FIB 解決(jue)方案，為您提(ti)供Coral Cryo工作(zuo)(zuo)流(liu)(liu)程的(de)(de)(de)所有優(you)勢。對于Thermo Scientific Aquilos的(de)(de)(de)用戶，我(wo)(wo)們(men)提(ti)供集成解決(jue)方案，通(tong)(tong)過(guo)將我(wo)(wo)們(men)的(de)(de)(de)樣本(ben)盒與(yu)Aquilo低溫FIB 的(de)(de)(de)硬件整(zheng)合，進一步(bu)減少工作(zuo)(zuo)流(liu)(liu)程的(de)(de)(de)步(bu)驟。

精(jing)簡的(de)(de)端到端Coral Cryo工作(zuo)流程提供了明確的(de)(de)步驟、模(mo)塊和無縫的(de)(de)硬件(jian)(jian)和軟(ruan)件(jian)(jian)接口。由(you)于無縫的(de)(de)硬件(jian)(jian)和軟(ruan)件(jian)(jian)接口，Coral Cryo可以快速部署(shu)在您的(de)(de)設施(shi)或實驗室。

熒光結構的三維定(ding)位用于冷凍(dong)電子斷層掃描

熒光結構(gou)的三(san)維定位用于冷凍電(dian)子斷(duan)層掃描。薄片(pian)轉(zhuan)移到(dao)低溫TEM上(shang)。由德國Martinsried的Max-Planck生物化學研究所的Anna Bieber和Cristina Capitanio友情提(ti)供；Stem由Florian Wilfling提(ti)供。

通過超分辨率(lv)的(de)低溫(wen)共(gong)聚(ju)焦顯微鏡識(shi)別(bie)熒光結構。使用樣(yang)本周圍的(de)珠子(zi)作為(wei)相關標記，可(ke)以在低溫(wen)FIB-SEM上識(shi)別(bie)目標結構，并從細胞體積中(zhong)磨出含有目標結構的(de)薄(bo)(bo)片。薄(bo)(bo)片被轉移到低溫(wen)TEM上，記錄(lu)薄(bo)(bo)片的(de)傾(qing)斜系列。從傾(qing)斜系列中(zhong)可(ke)以計算出三(san)維體積，其分辨率(lv)可(ke)達亞納(na)米級，并為(wei)可(ke)視(shi)化和分析創建一個渲染圖。

· A - 共聚(ju)焦三維體積的最大(da)強度(du)投影。目(mu)標結(jie)構(gou)（表達(da)Ede1-eGFP的酵母細胞，參與(yu)凝集素介(jie)導的內(nei)吞作用）由(you)一個箭頭描述出來。

· B - FIB研磨后的TEM中(zhong)的FIB片層，疊(die)加(jia)Ede1-eGFP的熒光。

· C - 片層體積(ji)斷層圖的示例(li)性圖像。正(zheng)方形表示圖像D的位置。

· D-斷層圖的(de)(de)細節，描繪了相分離的(de)(de)內細胞蛋白沉積(ji)。

比例尺：A - 內部網格方塊的寬度。90μm，條寬：35 µm.B, C, D - 插入(ru)物的邊緣長度為2微米(mi)。

LNG-non-LNGHeLa細胞(bao)標(biao)記(ji)色(se)：深藍(lan)色(se)-Hoechst，細胞(bao)核；綠色(se)-MitoTracker Green，線粒體；紅色(se)-Bodipy，脂質滴。白(bai)色(se)-珠子，反射(she)模(mo)式-網格(ge)條。細胞(bao)由德國海德堡歐洲分子生物(wu)學實(shi)驗(yan)室（EMBL）Mahamid Group的(de)Ievgeniia Zagoriy友情(qing)提供。