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本(ben)文展示(shi)了如何使用THUNDER Imager Tissue和Large Volume Computational Clearing（LVCC）實現尤文（尤因）肉瘤細胞中有絲分裂紡錘體的更多細節觀察，從而協助本(ben)研究(jiu)的(de)(de)進(jin)行。活細(xi)胞成(cheng)像等技(ji)術(shu)在了解(jie)腫瘤(liu)(liu)進(jin)展和轉移(yi)研究(jiu)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)至關重(zhong)(zhong)要。真(zhen)核細(xi)胞中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)有絲(si)(si)分(fen)裂紡錘體由中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)空的(de)(de)微管組(zu)成(cheng)。它在有絲(si)(si)分(fen)裂期間的(de)(de)細(xi)胞內重(zhong)(zhong)復染(ran)色(se)體分(fen)離和分(fen)裂細(xi)胞細(xi)胞骨架結構(gou)的(de)(de)構(gou)建過程中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)發揮著重(zhong)(zhong)要的(de)(de)作(zuo)用。在尤文肉瘤(liu)(liu)這一類的(de)(de)腫瘤(liu)(liu)細(xi)胞中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)，有絲(si)(si)分(fen)裂障礙的(de)(de)觸發因子可通過檢(jian)查有絲(si)(si)分(fen)裂紡錘體的(de)(de)機能(neng)障礙來得以確認。
簡介(jie)
使用熒光顯微鏡可以(yi)研究腫瘤形成(cheng)和進(jin)展過(guo)程中(zhong)組織及(ji)細胞(bao)內部發生的變(bian)化。像活細胞成像這樣的技術(shu)對更加(jia)深入(ru)地了(le)解腫瘤進展和(he)轉移是至關重(zhong)要的。
在真核(he)細(xi)胞中(zhong)，由中(zhong)空微(wei)管組成的有(you)絲分裂紡錘體(ti)，有助于(yu)構建復制細胞的細胞骨架結構，并(bing)在有絲分裂過(guo)程中將復制的(de)染色體從原始細胞(bao)中分離出來(lai)。在尤文肉(rou)瘤這一類的(de)腫瘤細胞(bao)中，有絲分裂障礙的(de)觸發因子可(ke)通過(guo)檢查有絲分裂紡錘(chui)體的(de)機能障礙來(lai)得以確認[1]。
肉瘤是肌肉或骨骼等結締組織中形成的一類腫瘤。尤文肉瘤和橫紋肌肉瘤，分別生長于骨骼和肌肉中，是一種傾向于發生在骨骼生長活躍區域附近的兒科腫瘤。除了手術和化療之外，電離輻射也被用于治療這類腫瘤，但這可能會導致生長中的骨骼受到yong久性損傷，包括不對稱生長停滯、脛骨畸形及骨折概率增加等。骨骼損傷的嚴重度在很大程度上與骨骼接受的輻射劑量成正比。因此，我們有理由認為，選(xuan)擇性放射(she)致敏腫瘤(liu)組(zu)織的策(ce)略可降低實現(xian)局部控制所需的輻(fu)射(she)劑量(liang)，并能最大限度降低對鄰(lin)近健(jian)康組(zu)織造(zao)成的間接損傷。
運用體外研究和小鼠異種移植模型系統，對使用mRNA合成抑制劑光神霉素A預處理，可以通過改變輻射損傷的轉錄反應實現選擇性放射致敏EWS：Fli1+腫瘤細胞的假設進行了驗證[2]。結果表明，光神霉素A可以通過抑制參與DNA損傷修復相關基因的轉錄，使EWS：Fli1+細胞在體內外顯著放射增敏，導致腫瘤細胞程序性死亡[2]。
使用THUNDER Imager Tissue和(he)Large Volume Computational Clearing（LVCC）可以揭示肉瘤細胞中有絲分(fen)裂紡錘體的更多細節，協助癌(ai)癥研究人員獲(huo)得(de)更有用的(de)見解。
挑戰
在有絲分裂紡錘體成像中，可對其實現快速成像，并獲得清晰的(de)高對比度3D成像，以清(qing)晰展示重要細節的解決方案最為實用。傳統的寬場顯微成像速度快，檢測靈敏度高，但不幸的是對于厚樣本的成像通常會出現失焦不清晰或模糊的情況，這會降低對比度[3]。要闡明有絲分裂的不穩定(ding)性在癌癥等復雜疾病中的作(zuo)用，這需要在同一樣本中進行多個(ge)關(guan)聯生物學標(biao)記。
方(fang)法
該研究中使用了尤文肉瘤細胞（SK-ES-1）。對這些細胞進行α-微管蛋白（Clone YL1/2 Thermo-Fisher Scientific # MA1-80017，按1:500比例稀釋/ Dylight 488偶聯驢抗大鼠 Thermo-Fisher Scientific #SA5-10026）、γ-微管蛋白（Clone TU-30，AbCam # ab27074，按1:200比例稀釋/Dylight 550偶聯驢抗小鼠 Thermo-Fisher Scientific # SA5-10167）和DNA（Hoechst 33342藍）進行染色。染色后，使用介質ProLong Glass Antifade（Thermo-Fisher Scientific #P36981）進行蓋玻片封片，并通過使用63×/1.4 NA（數值孔徑）的油鏡進行THUNDER Imager Tissue成像。圖像采集使(shi)用大(da)體積成像解析(xi)（LVCC）[3]模式，并生(sheng)成zui大(da)化(hua)投(tou)影圖(tu)像數據。
結果
在有絲分裂過程中，α-微管蛋白（綠色）形成有絲分裂紡錘體，染色單體（藍色）會附著在有絲分裂紡錘體上，而γ-微管蛋白（紅色）集中定位在分裂細胞中的紡錘極上。通過THUNDER技術(shu)可(ke)觀(guan)察到肉(rou)瘤細胞中有(you)絲分裂紡錘體的更多細節。清晰的圖像(xiang)可以(yi)展示(shi)清晰的結構，以(yi)便進行分(fen)割和進一步的分(fen)析。
圖(tu)(tu)1：尤文肉瘤細胞(bao)SK-ES-1 α-微管蛋白(bai)（綠色）、γ-微管蛋白(bai)（紅色）和DNA（藍色）染色后(hou)的最da化投影(ying)：原始圖(tu)(tu)像數據(ju)（左）和THUNDER LVCC模式(shi)成(cheng)像數據(ju)（右）。
結 論
THUNDER Large Volume Computational Clearing（LVCC）[3]進(jin)行尤文肉瘤細(xi)胞中的(de)有(you)絲分裂(lie)紡錘體成像時可顯著增(zeng)強對比(bi)度。與(yu)傳(chuan)統的(de)寬場成像相比(bi)，其可展示細胞中有絲分裂紡錘體的更多細節。
References：
1.S. Rello-Varona, D. Herrero-Martín, L. Lagares-Tena, R. López-Alemany, N. Mulet-Margalef, J. Huertas-Martínez, S. Garcia-Monclús, X. García del Muro, C. Mu?oz-Pinedo, O. Martínez Tirado, The importance of being dead: cell death mechanisms assessment in anti-sarcoma therapy, Frontiers in Oncology (2015) vol. 5, p. 82, DOI: 10.3389/fonc.2015.00082.
2.M. Yun Lin, T.A. Damron, M.E. Oest, J.A. Horton, Mithramycin A Radiosensitizes EWS:Fli1+ Ewing Sarcoma Cells by Inhibiting Double Strand Break Repair, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. (2021) vol. 109, iss. 5, pp. 1454-1471, DOI: 10.1016/j.ijrobp.2020.12.010.
3.J. Schumacher, L. Bertrand, THUNDER Technology Note : THUNDER Imagers: How Do They Really Work? Science Lab (2019) Leica Microsystems.
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