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要用(yong)顯微鏡在高(gao)倍鏡下(xia)檢查標(biao)本，有許多(duo)因素需要考慮。其中包括分辨率、數值孔徑（NA）、物鏡的(de)工作距離以及物鏡前透鏡采集圖像所(suo)用(yong)介(jie)質的(de)折射率。在這篇文章中，我(wo)們將(jiang)簡要地看(kan)一(yi)下如何在蓋玻片(pian)和物鏡(jing)前透鏡(jing)之間利用(yong)浸泡介(jie)質幫助(zhu)提高(gao)NA和分(fen)辨率。此外(wai)，我們還(huan)將考慮空氣和構成載玻(bo)(bo)片、蓋玻(bo)(bo)片的玻璃的折射率，以及當光從一(yi)種介(jie)質傳播到(dao)另一(yi)種介(jie)質時，如何使用(yong)浸沒(mei)介質部分地減(jian)少錯配。此外，文中還提供(gong)了使用(yong)油浸式物鏡的實(shi)用(yong)技巧以及水浸式物鏡的優勢，特(te)別是(shi)針對活細胞的成(cheng)像。
光學(xue)顯微(wei)鏡(jing)所面臨的主要問題之一是克服某些光學分辨率的限制并提高系統的NA值。簡言之，物鏡的NA是指從標本中收集光的能力，而分辨率是指物鏡分辨標本中細節的能力。
分辨率和NA將在其他文章中詳細說明，我們現在將介紹顯(xian)微鏡專家(jia)可(ke)用的浸沒技術，這種技術(shu)可在高倍放大率(lv)(lv)下對標(biao)本進行成像，同時克服(fu)分辨(bian)率(lv)(lv)的一些限制。
在物鏡前透鏡和標本蓋玻片之間的空隙中填充浸沒液體可提高物鏡的分辨率。當光從一種介質傳遞到另一種介質（例如，通過玻璃到空氣）時會發生折射 - 換句話說，光會彎曲并散射。任何折射到空氣中的光線、被蓋玻片反射的光線或被物鏡前透鏡的金屬外殼實際阻擋的光線都不會對成像產生貢獻。浸沒液體的(de)目的(de)在于(yu)減(jian)少光在標本上形成的(de)折射(she)和反射(she)，并(bing)提升物鏡捕捉這些偏(pian)離光的(de)能力（見圖1）。
圖1
光線穿過的(de)(de)介質的(de)(de)物(wu)理性質決(jue)定(ding)了光線被折射(she)的(de)(de)程(cheng)度。“折射(she)率"是一個數值（沒有單位），該(gai)數值決(jue)定(ding)了光通過材料時的(de)(de)折射(she)程(cheng)度。空氣的(de)(de)折射(she)率為1.0，而顯微鏡載玻片和蓋玻片(pian)的折(zhe)射(she)率通常為(wei)1.5。考慮到這(zhe)一差(cha)異，浸泡液(ye)體的(de)(de)目的(de)(de)是(shi)匹(pi)配（盡可能接近）玻片的(de)(de)折射率(lv)，從而增加形成最終(zhong)圖像的(de)(de)光線量。隨后，大(da)多數浸油的折射率(lv)為1.51。常見(jian)折射率(lv)見(jian)表(biao)1。
浸沒介質 | RI |
空氣 | 1.00 |
水 | 1.33 |
甘油（100%） | 1.47 |
香柏油 | 1.51 |
徠卡(ka)浸沒油（標準和“F"型） | 1.51 |
玻片 | RI |
玻片（硼硅(gui)酸鹽或“Parex"） | 1.47 |
玻片（冕玻璃或(huo)鈉鈣硅玻璃） | 1.51 |
封片介質 | RI |
細胞培養基 | 1.31至1.33 |
Fluoromount-G™ | 1.4 |
ProLong®/ProLong® Gold | 1.46 |
VECTASHIELD® | 1.44 |
VECTASHIELD® Hard+Set™ | 1.46 |
Mowiol® | 1.41 – 1.49 |
理想情形是創建所謂的“均質浸沒系統"。使用該系統可以獲得最大的分辨率和NA。均質浸沒系統的目的是匹配（盡可能接近）物鏡前透鏡、浸沒介質、蓋玻片/載玻片、封片劑和（原則上）聚光鏡透鏡的折射率和NA（見圖2和表1）。
通常不需要在聚光鏡的透鏡上使用浸沒液體。如果顯微鏡(jing)的設(she)置和校準(zhun)正確(que)，且在整個樣本上獲得最佳對比度和照明度（見“關于科勒照明"的文章），則聚光鏡將處于最適宜的位置和設置，從而有助于(yu)顯微鏡系統的(de)整體NA。
圖2：標本和物鏡前透鏡之間所有光學元件的折射率會給圖像質量帶來很大影響。理想情況下，它們應盡可能緊密地相互匹配，如本例中的標本使用甘油基封片劑。
顯微鏡物鏡需要考慮的另一個因素是“工作距(ju)離"。這是當樣本處于銳聚焦時，物鏡前透鏡和蓋玻片表面之間的實際距離（見圖3）。當物鏡移到離載玻片更近的位置時，焦平面進一步移向樣本中。然而，這在物理上受到限制，因為物鏡只有在接觸到蓋玻片后才能移動。工作距離與每個物鏡的放大倍數成反比關系。例如，10倍物鏡的工作距離可能為4 mm，而100倍油浸物鏡的工作距離通常為0.13 mm。相比之下，一些水浸/水澆蘸（Water Dipping）物鏡的工作距離約為3 mm。工(gong)作距離是(shi)另一條信息，通(tong)常刻在物鏡筒上，縮(suo)寫(xie)為“WD"（不(bu)要與水鏡混淆-見下(xia)文）。
圖3
使用油浸物鏡時要記住的一個關鍵因素是使用正(zheng)確(que)匹配的浸(jin)油。只(zhi)能(neng)使(shi)用(yong)物鏡制造商推薦的(de)(de)油(you)。多(duo)年來，杉木油(you)是常用(yong)于浸沒介質（目前仍(reng)在市場上出(chu)售）。雖然這種油(you)的(de)(de)折射(she)率為1.516，但(dan)存在硬化趨勢(shi)，如(ru)果(guo)使(shi)用(yong)后(hou)不取出(chu)，可(ke)能(neng)會(hui)損壞(huai)透鏡。此外，這種油(you)會(hui)吸收藍色波長(chang)和紫(zi)外線，而且老化時會(hui)不斷變黃。
圖4
大多數現代化浸油都是人工合成并經過標準化處理，確保不會損壞透鏡或隨著老化而變色。要記住的一點是，浸油有(you)一個最佳的(de)工作(zuo)溫度。大多數商用合成油的設計工作溫度為23℃，僅1℃的變化將導致折射率變化0.0004。其他浸油可在不同溫度下獲得最佳性能，但對于大多數用途，顯微鏡設備應在23℃下保持穩定（這對于共聚焦顯微鏡等儀器的維護也很重要）。
使用油浸式物鏡（見圖4）開展熒光顯微鏡觀察時，建議使用特殊的低自體熒光油。很(hen)多通用浸油在特定情況下將會(hui)發出(chu)熒光。大多數用于(yu)熒光顯微鏡的浸(jin)油(you)都通過名稱/代碼之前(qian)或之后加(jia)上字母(mu)“F"來識別(bie)。
從使用低倍物鏡查看樣本開始，在切片上找到感興趣的區域。
逐步切換至40倍放大率并將顯微鏡設置科勒照明。
通過物鏡轉盤（物鏡的連接底座）在40x和100x物鏡之間切換但不要直接接觸高倍物鏡。
從顯微鏡的一側看去，小心地將1滴浸油直接滴到蓋玻片上。將高倍物鏡擺入到位（繼續從一側觀察載物臺），先粗調然后微調對焦，讓物鏡前透鏡與浸油發生接觸。有些油浸物鏡的前透鏡是凹面的，這意味著還應該在物鏡上滴一滴油以防止氣泡被困在凹透鏡中。
然后可以再次通過目鏡觀察。僅使用微調對焦來調整視野。雖然高倍物鏡含有彈簧加載式轉換器，但在這個階段粗聚焦很容易導致蓋玻片或載玻片破裂，也可能損壞物鏡前透鏡。
即便您計劃觀察其他載玻片，也應在此階段清除物鏡上的浸油以防止可能污染顯微鏡的其他部分。對于不適合浸沒的顯微鏡部件和物鏡，浸油會滲透并造成損壞。用鏡片清潔紙巾在鏡片上擦一次，去除多余的油。每次擦拭都要用干凈的紙巾擦拭物鏡前透鏡，直到沒有殘留油的痕跡。可使用市售除油溶液或少量二甲苯最終清潔透鏡。同樣，在對透鏡應用任何溶液之前，請務必仔細了解物鏡制造商的建議。
在研究級顯微(wei)鏡（通常是共聚焦顯微(wei)鏡）上(shang)有一(yi)種(zhong)不太(tai)常見的(de)浸沒式物鏡是“水浸"物(wu)鏡，通常在物鏡筒上(shang)縮寫為“WI"或“W"。當對(dui)細胞培養基中(zhong)的(de)活細胞成像時，強烈建議(yi)使用水浸(jin)(jin)式物鏡。有兩種類型(xing)的水浸(jin)(jin)式物鏡（見(jian)圖5）-“水浸(jin)(jin)"和“水澆(jiao)蘸"（物鏡筒上(shang)通常縮寫為(wei)“WD"，不要與“工(gong)作距離"混淆(xiao)）。
圖5
水浸式(shi)物(wu)鏡(jing)通常(chang)與正置顯微鏡(jing)配置一(yi)起使用，用于直接(jie)浸入(ru)水或水基(ji)介質/緩沖液中。水澆蘸物(wu)鏡則可(ke)提供(gong)很(hen)長的工作(zuo)距離。這種物(wu)鏡在生產時還配有(you)十分曲折的彎(wan)角(jiao)轉盤，使(shi)用(yong)惰性材料(liao)如陶瓷等制作(zuo)而(er)成。水浸物(wu)鏡的使(shi)用(yong)方式(shi)與油浸物(wu)鏡類似，但要用(yong)水代(dai)替油。
使用(yong)水浸(jin)式物鏡的優點之(zhi)一是簡單地(di)將水作為浸(jin)沒(mei)介質。很(hen)明(ming)顯，這(zhe)種介質很(hen)容易清(qing)洗(xi)。此外(wai)，您不需要根據正在進行的成(cheng)像使用特(te)定的浸沒油，也(ye)不需要使用顯微鏡和物(wu)鏡制造商zhiding的浸(jin)沒(mei)介質。但(dan)使用水(shui)浸(jin)式物(wu)鏡(jing)(jing)(jing)時有(you)一(yi)(yi)些缺(que)點。與水(shui)性物(wu)鏡(jing)(jing)(jing)相(xiang)比，油浸(jin)物(wu)鏡(jing)(jing)(jing)具有(you)更高的分辨率。此外，由于水(shui)的粘度（與油相(xiang)比），使用水(shui)浸(jin)式物(wu)鏡(jing)(jing)(jing)容易受(shou)到振(zhen)動(dong)和小空氣運(yun)動(dong)的影響。這種問題(ti)可(ke)以通過確保顯微鏡(jing)(jing)(jing)放置在防振(zhen)臺上來(lai)克服(fu)。或者(zhe)，更簡單的解決方(fang)案是在切片(pian)上放置一(yi)(yi)個特殊的環來(lai)形成(cheng)一(yi)(yi)個小水(shui)池。水(shui)浸(jin)式物(wu)鏡(jing)(jing)(jing)的最(zui)后一(yi)(yi)個缺(que)點是成(cheng)本。一(yi)(yi)些水(shui)浸(jin)式物(wu)鏡(jing)(jing)(jing)的成(cheng)本相(xiang)當(dang)于一(yi)(yi)套完整(zheng)的研究級顯微鏡(jing)(jing)(jing)。
徠卡(ka)提供的水(shui)浸顯微鏡自動加水(shui)裝置(zhi)克服了長時間(jian)活細胞成像或篩查(cha)實驗中出現水(shui)蒸(zheng)發的潛在問題(ti)（見圖6）。
圖6：水浸顯微鏡自動加水裝置在實驗運行中自動添加浸沒用水。
活細胞(bao)(bao)(bao)通常置于細胞(bao)(bao)(bao)間室并且(qie)會被細胞(bao)(bao)(bao)培養基（或緩沖液）所覆蓋。間室（和培養基）有助于確保細胞或組織在成像的同時處于穩定的環境內。因此，到小室蓋片的最佳焦距將變得比較大，這使得工作距離較短的油浸式物鏡不適合通過蓋玻片/間室、培養基/緩沖液對細胞/組織成像。
此外，使(shi)用油浸式物鏡來觀察水性培養基內(nei)的(de)細胞時還(huan)會增加額外的(de)折射問題，因為油和(he)水的(de)折(zhe)射率不同(tong)。
觀察(cha)間室內的活(huo)細(xi)胞時，光路將遇到不同的折射率。間室/蓋玻片的材料(liao)和(he)覆蓋細(xi)胞或組織(zhi)的水性培(pei)養基之間存在(zai)不同的折射率。從標本圖像(xiang)中傳出的光將在(zai)每個階(jie)段發生折射而(er)導致球面像差。
圖(tu)7：可(ke)以調節物鏡的(de)校(xiao)正環以適配不同厚(hou)度的(de)蓋玻片。電(dian)動校(xiao)正環可(ke)優化設置，把干擾降低(di)到(dao)最小。
最后，水浸式(shi)物(wu)鏡(jing)最為適(shi)合的應(ying)用之一是(shi)活細胞的共聚焦成像，因(yin)此水浸式(shi)物(wu)鏡(jing)通常是(shi)許多共焦系統的標配(pei)。由于水與(yu)油相比粘度較低，使用這些物鏡可(ke)降低對蓋(gai)玻片的(de)(de)表(biao)面張力，這意(yi)味著標本發生移位的(de)(de)可(ke)能性較小，尤其是(shi)在采集Z軸(zhou)疊加的(de)(de)過程中。
圖8：對于使用折射率接近于甘油/水混合物的封片劑（如VECTASHIELD® Hard+SetTM）樣本，甘油物鏡是較佳選擇。
甘油是另一種浸沒介質(zhi)。很多固(gu)定樣本都使用Mowiol、Vectashield或類(lei)似的(de)甘(gan)油(you)基封(feng)片(pian)劑封(feng)片(pian)（見(jian)表1）。這(zhe)些介質(zhi)的(de)折(zhe)射率接近于80/20 甘(gan)油(you)/水混合溶液的(de)折(zhe)射率（RI=1.45）。對于此(ci)類(lei)封(feng)片(pian)劑封(feng)片(pian)標(biao)本，甘(gan)油(you)物鏡（見(jian)圖8）是(shi)zuijia選(xuan)擇。
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